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          微管相關蛋白MAP11 (C7orf43)突變導致人類和斑馬魚出現小頭癥
          來源: | 作者:bioservice | 發布時間: 2020-06-18 | 910 次瀏覽 | 分享到:

          文章標題:Mutations in the microtubule-associated protein MAP11(C7orf43) cause microcephaly in humans and zebrafish

          期刊雜志:brain(IF=11.814)

          發表時間:2019年1月30日

          研究單位:以色列本?古里安大學


          研究背景及概述

                 微管相關蛋白11 (MAP11,以前稱為C7orf43)編碼一種高度保守的未知功能蛋白。通過全基因組聯動分析結合全外顯子組測序,我們證實了人類常染色體隱性原發性小頭畸形是由MAP11基因的截斷突變引起的。此外,CRISPR/Cas9敲除斑馬魚純合子MAP11同源基因表現為小頭畸形和神經元增殖減少,印證了人類表型。我們證明MAP11在大腦和小腦中普遍轉錄,且轉錄水平較高。在SH-SY5Y細胞中進行的免疫熒光和免疫共沉淀研究表明,MAP11與有絲分裂紡錘體相關,在有絲分裂過程中與a—微管蛋白發生共定位和物理聯系。MAP11的表達先于a—微管蛋白在中體細胞脫落間隙中形成,而且與胞質分裂的關鍵調控因子PLK1共同定位于胞質分裂后子細胞微管延伸的邊緣,提示其在胞質分裂過程中參與有絲分裂紡錘體動力學和細胞分裂調控。最后,慢病毒介導的MAP11沉默降低了SH-SY5Y細胞的活力和增殖能力,而不是影響凋亡。因此,MAP11是一種在紡錘體動力學和細胞分裂中發揮作用的微管相關蛋白的編碼基因,該基因的突變導致人類和斑馬魚出現小頭畸形。


          研究思路與方法

          1、原發性小頭畸形家系樣品GWS分析結合全外顯子組測序確定MAP11 (C7orf43)突變可能為致病突變→ 慢病毒sh RNA介導的MAP11 (C7orf43)沉默→ 細胞活性檢查 → 共聚焦成像 → 克隆與免疫共沉淀 → 細胞增殖實驗

          2、生成MAP11(c7orf43)特異性sgRNAs → CRISPR/Cas9斑馬魚突變體小頭癥表型驗證 → TUNEL法檢測斑馬魚整體細胞凋亡→ 斑馬魚整體增殖試驗


          主要研究成果

          1、 疾病表型和基因研究

           同一個家系的三個患者,表現為明顯的退行性原發性小頭畸形。(Figure 1A、B)所有患者均在正常妊娠后足月出生,出生體重正常。在出生時,枕額周圍低于2sd,隨著小頭畸形的疾病進展。明顯智力落后,最顯著的影響是語言和表達能力,2-3周歲也僅僅只能三個字的表達。

                通過GWS家系連鎖分析,將致病基因定位于兩個可能區域,包括SNPs rs930875和rs6894609之間的5號染色體上的一個5.9Mb區域和SNPsrs17165823和rs2215815之間的7號染色體上的一個12.4 Mb區域(Fig.1C)。用全外顯子測序(WES)對II:4與正常序列比對,未發現該患者在5號染色體有純合突變,而在所有患者的7號染色體均發現一純合有害突變c.613G>T, p.(E205*),在7號染色體開放閱讀框43 (C7orf43,現在稱為MAP11)中作為唯一可能的致病突變。該基因高度保守,并在腦組織中高度表達,經過預實驗,預測MAP11c.613G>T突變可導致截短突變,通過刪除其近三分之二的C '端產生異常蛋白。



          2、 MAP11定位與交互

                 在SH-SY5Y 細胞中,MAP11和a—微管蛋白染色顯示:兩者的共定位主要發生在有絲分裂的后期和末期(圖2A)。在末期細胞分裂中,我們發現a—微管蛋白先于中體微管間隙形成,導致細胞脫落,而MAP11仍然是連續的、未被破壞的(2B),說明MAP11在細胞分裂和細胞脫落中發揮作用。內源性MAP11和PLK1的免疫染色(細胞分裂的關鍵調控因子,在中體組裝和溝裂形成中起關鍵作用),在部分共定位的末期,MAP11在紡錘體中部區域被PLK1環繞,在脫落過程中,MAP11和PLK1似乎在脫落后的每個子細胞微管延伸的邊緣同時定位(圖2C)。免疫共沉淀分析表明,在SH-SY5Y過表達裂解物中,MAP11與a—微管蛋白在物理上存在關聯,a—微管蛋白可以與MAP11共沉淀(圖2D)。因此,MAP11在有絲分裂過程中通過a—小管蛋白相互作用與微管紡錘體相關,在細胞分裂和細胞脫落過程中MAP11與PLK1共同定位。



          3、 MAP11基因敲除與增殖實驗

                為了MAP11的表征功能驗證,我們對MAP11在SH-SY5Y細胞中的表達進行了沉默。采用RT-qPCR檢測慢病毒shRNA介導的MAP11沉默的效果:sh RNA_A的MAP11 m RNA水平沉默至40%,sh RNA_B沉默至58%,兩者與對照組相比均具有統計學意義(Fig.3A)。MAP11沉默SH-SY5Y細胞的細胞活力測定(XTT)顯示,與shRNA對照細胞相比,shRNA_A和shRNA_B的細胞活力均較低,具有統計學意義(Fig.3B)。我們推測這可能是這可能與MAP11基因敲除細胞凋亡增加或增殖能力下降有關。事實上,增殖實驗表明,與sh RNA對照細胞相比,MAP11沉默細胞的增殖能力較差(FACS分析中Ki-67陽性細胞的比例)(圖3C和D)



                為了確定MAP11的體內功能,我們使用CRISPR/Cas9構建了MAP11同源基因敲除斑馬魚模型。我們將sgRNA和Cas9蛋白,無論是否以ss ODN寡核苷酸為HDR模板,注射到單細胞階段胚胎(f0)中,產生了許多突變系(10%的注射胚胎出現遺傳變異)。選擇1個敲除系(MAP11- ko)和1個突變系(MAP11-á21)進行進一步分析。通過繁殖f1雜合子,我們產生了f2斑馬魚后代,在MAP11-KO和MAP11-A21系中都顯示出正常的孟德爾固有比率(數據未顯示)。接下來,我們測量了受精后28天的頭體面積比,f2 MAP11-KO和MAP11-á21雜合子的頭體比與對照野生型相似,但兩種純合突變體的頭體比均明顯低于野生型或雜合子對照。值得注意的是,map11-KO的頭體比略高于map11-á21。這些比率在野生型和雜合子攜帶者中也保持著,這可能源于它們的創始人的遺傳特性。因此,在兩個被敲除的斑馬魚系中觀察到的較小的頭部尺寸,概括了常染色體隱性遺傳和人類小頭畸形表型。我們也注意到,觀察到的較小的頭部尺寸在一定程度上可能是由于斑馬魚前后軸縮短。因此,map11功能喪失可能減少了神經細胞的增殖,導致兩個突變的斑馬魚系的頭部變小,從而概括了人類的小頭畸形表型。



          討論

            MAP11蛋白在所有脊椎動物中高度保守。它沒有可識別的結構域,也沒有關于其功能的文獻報道。通過RT-PCR分析MAP11在各種正常人體組織中的均有表達,發現MAP11在腦、小腦、睪丸和全血中普遍存在,但轉錄率較高,符合與GTEx portal數據一致。常染色體隱性主頭小畸型的病人的特點是遲緩,嚴重的智力障礙,語言障礙,多動癥和變形特性(圖1 a, B),除了頭小畸型,減少白質和薄胼胝體(圖1 B),沒有明顯的大腦結構異常。一名患者(患者II:3)患有終末絲狀脊髓栓系和脂肪瘤,這一發現與MAP11突變不一定相關。由于原發性小頭癥通常是神經祖系或神經干細胞細胞周期調控和進展失調的結果,我們推測MAP11可能參與細胞存活。后我們通過shrna介導的沉默MAP11 sh - SY5Y細胞,我們發現,與對照組相比,MAP11表達降低的細胞存活率(XTT法)更低(Fig. 3A andB)。這可能是由于MAP11基因敲除細胞凋亡增加或增殖能力下降所致。通過熒光激活細胞分選(FACS)分析,我們發現存活率測定的差異是由于增殖率較低,而不是凋亡(圖3B-D)。

           為了進一步驗證我們的遺傳學研究,我們在斑馬魚體內進行了實驗,利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術,我們產生了兩條斑馬魚MAP11基因敲除序列。通過對斑馬魚頭體面積比的分析,我們發現,與雜合攜帶者和野生型斑馬魚相比,雜合突變斑馬魚的頭更小。因此,斑馬魚突變表型再現了人類小頭畸形表型。除了整體頭部尺寸減小,我們還發現突變斑馬魚頭部前后軸縮短。根據MAP11 SH- SY5Y敲除細胞的增殖和凋亡數據,我們發現野生型和MAP11 -ko斑馬魚的細胞凋亡水平(全身)沒有差異。有趣的是,我們證明與野生型相比,map11- ko斑馬魚的腦細胞增殖減少,這表明map11對斑馬魚神經發育早期的神經元增殖很重要。這與原發性小頭癥的一個關鍵分子特征是一致的,神經干細胞的低增殖能力導致一個枯竭的祖細胞池,不能產生足夠數量的神經元來填充正在生長的新皮質。

                總的來說,通過體外和體內的研究,我們證實了C7orf43(現在稱為MAP11)與有絲分裂紡錘體有關,并且在有絲分裂過程中與a-微管蛋白共同定位,并在生理上與a-微管蛋白結合,從而影響細胞增殖。我們證明了MAP11在中體細胞脫落間隙形成中先于A-微管蛋白的表達,并且在每個子細胞胞質分裂脫落后的微管延伸邊

          研究背景及概述

                 微管相關蛋白11 (MAP11,以前稱為C7orf43)編碼一種高度保守的未知功能蛋白。通過全基因組聯動分析結合全外顯子組測序,我們證實了人類常染色體隱性原發性小頭畸形是由MAP11基因的截斷突變引起的。此外,CRISPR/Cas9敲除斑馬魚純合子MAP11同源基因表現為小頭畸形和神經元增殖減少,印證了人類表型。我們證明MAP11在大腦和小腦中普遍轉錄,且轉錄水平較高。在SH-SY5Y細胞中進行的免疫熒光和免疫共沉淀研究表明,MAP11與有絲分裂紡錘體相關,在有絲分裂過程中與a—微管蛋白發生共定位和物理聯系。MAP11的表達先于a—微管蛋白在中體細胞脫落間隙中形成,而且與胞質分裂的關鍵調控因子PLK1共同定位于胞質分裂后子細胞微管延伸的邊緣,提示其在胞質分裂過程中參與有絲分裂紡錘體動力學和細胞分裂調控。最后,慢病毒介導的MAP11沉默降低了SH-SY5Y細胞的活力和增殖能力,而不是影響凋亡。因此,MAP11是一種在紡錘體動力學和細胞分裂中發揮作用的微管相關蛋白的編碼基因,該基因的突變導致人類和斑馬魚出現小頭畸形。


          研究思路與方法

          1、原發性小頭畸形家系樣品GWS分析結合全外顯子組測序確定MAP11 (C7orf43)突變可能為致病突變→ 慢病毒sh RNA介導的MAP11 (C7orf43)沉默→ 細胞活性檢查 → 共聚焦成像 → 克隆與免疫共沉淀 → 細胞增殖實驗

          2、生成MAP11(c7orf43)特異性sgRNAs → CRISPR/Cas9斑馬魚突變體小頭癥表型驗證 → TUNEL法檢測斑馬魚整體細胞凋亡→ 斑馬魚整體增殖試驗


          主要研究成果

          1、 疾病表型和基因研究

           同一個家系的三個患者,表現為明顯的退行性原發性小頭畸形。(Figure 1A、B)所有患者均在正常妊娠后足月出生,出生體重正常。在出生時,枕額周圍低于2sd,隨著小頭畸形的疾病進展。明顯智力落后,最顯著的影響是語言和表達能力,2-3周歲也僅僅只能三個字的表達。

                通過GWS家系連鎖分析,將致病基因定位于兩個可能區域,包括SNPs rs930875和rs6894609之間的5號染色體上的一個5.9Mb區域和SNPsrs17165823和rs2215815之間的7號染色體上的一個12.4 Mb區域(Fig.1C)。用全外顯子測序(WES)對II:4與正常序列比對,未發現該患者在5號染色體有純合突變,而在所有患者的7號染色體均發現一純合有害突變c.613G>T, p.(E205*),在7號染色體開放閱讀框43 (C7orf43,現在稱為MAP11)中作為唯一可能的致病突變。該基因高度保守,并在腦組織中高度表達,經過預實驗,預測MAP11c.613G>T突變可導致截短突變,通過刪除其近三分之二的C '端產生異常蛋白。



          2、 MAP11定位與交互

                 在SH-SY5Y 細胞中,MAP11和a—微管蛋白染色顯示:兩者的共定位主要發生在有絲分裂的后期和末期(圖2A)。在末期細胞分裂中,我們發現a—微管蛋白先于中體微管間隙形成,導致細胞脫落,而MAP11仍然是連續的、未被破壞的(2B),說明MAP11在細胞分裂和細胞脫落中發揮作用。內源性MAP11和PLK1的免疫染色(細胞分裂的關鍵調控因子,在中體組裝和溝裂形成中起關鍵作用),在部分共定位的末期,MAP11在紡錘體中部區域被PLK1環繞,在脫落過程中,MAP11和PLK1似乎在脫落后的每個子細胞微管延伸的邊緣同時定位(圖2C)。免疫共沉淀分析表明,在SH-SY5Y過表達裂解物中,MAP11與a—微管蛋白在物理上存在關聯,a—微管蛋白可以與MAP11共沉淀(圖2D)。因此,MAP11在有絲分裂過程中通過a—小管蛋白相互作用與微管紡錘體相關,在細胞分裂和細胞脫落過程中MAP11與PLK1共同定位。



          3、 MAP11基因敲除與增殖實驗

                為了MAP11的表征功能驗證,我們對MAP11在SH-SY5Y細胞中的表達進行了沉默。采用RT-qPCR檢測慢病毒shRNA介導的MAP11沉默的效果:sh RNA_A的MAP11 m RNA水平沉默至40%,sh RNA_B沉默至58%,兩者與對照組相比均具有統計學意義(Fig.3A)。MAP11沉默SH-SY5Y細胞的細胞活力測定(XTT)顯示,與shRNA對照細胞相比,shRNA_A和shRNA_B的細胞活力均較低,具有統計學意義(Fig.3B)。我們推測這可能是這可能與MAP11基因敲除細胞凋亡增加或增殖能力下降有關。事實上,增殖實驗表明,與sh RNA對照細胞相比,MAP11沉默細胞的增殖能力較差(FACS分析中Ki-67陽性細胞的比例)(圖3C和D)



                為了確定MAP11的體內功能,我們使用CRISPR/Cas9構建了MAP11同源基因敲除斑馬魚模型。我們將sgRNA和Cas9蛋白,無論是否以ss ODN寡核苷酸為HDR模板,注射到單細胞階段胚胎(f0)中,產生了許多突變系(10%的注射胚胎出現遺傳變異)。選擇1個敲除系(MAP11- ko)和1個突變系(MAP11-á21)進行進一步分析。通過繁殖f1雜合子,我們產生了f2斑馬魚后代,在MAP11-KO和MAP11-A21系中都顯示出正常的孟德爾固有比率(數據未顯示)。接下來,我們測量了受精后28天的頭體面積比,f2 MAP11-KO和MAP11-á21雜合子的頭體比與對照野生型相似,但兩種純合突變體的頭體比均明顯低于野生型或雜合子對照。值得注意的是,map11-KO的頭體比略高于map11-á21。這些比率在野生型和雜合子攜帶者中也保持著,這可能源于它們的創始人的遺傳特性。因此,在兩個被敲除的斑馬魚系中觀察到的較小的頭部尺寸,概括了常染色體隱性遺傳和人類小頭畸形表型。我們也注意到,觀察到的較小的頭部尺寸在一定程度上可能是由于斑馬魚前后軸縮短。因此,map11功能喪失可能減少了神經細胞的增殖,導致兩個突變的斑馬魚系的頭部變小,從而概括了人類的小頭畸形表型。



          討論

            MAP11蛋白在所有脊椎動物中高度保守。它沒有可識別的結構域,也沒有關于其功能的文獻報道。通過RT-PCR分析MAP11在各種正常人體組織中的均有表達,發現MAP11在腦、小腦、睪丸和全血中普遍存在,但轉錄率較高,符合與GTEx portal數據一致。常染色體隱性主頭小畸型的病人的特點是遲緩,嚴重的智力障礙,語言障礙,多動癥和變形特性(圖1 a, B),除了頭小畸型,減少白質和薄胼胝體(圖1 B),沒有明顯的大腦結構異常。一名患者(患者II:3)患有終末絲狀脊髓栓系和脂肪瘤,這一發現與MAP11突變不一定相關。由于原發性小頭癥通常是神經祖系或神經干細胞細胞周期調控和進展失調的結果,我們推測MAP11可能參與細胞存活。后我們通過shrna介導的沉默MAP11 sh - SY5Y細胞,我們發現,與對照組相比,MAP11表達降低的細胞存活率(XTT法)更低(Fig. 3A andB)。這可能是由于MAP11基因敲除細胞凋亡增加或增殖能力下降所致。通過熒光激活細胞分選(FACS)分析,我們發現存活率測定的差異是由于增殖率較低,而不是凋亡(圖3B-D)。

           為了進一步驗證我們的遺傳學研究,我們在斑馬魚體內進行了實驗,利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術,我們產生了兩條斑馬魚MAP11基因敲除序列。通過對斑馬魚頭體面積比的分析,我們發現,與雜合攜帶者和野生型斑馬魚相比,雜合突變斑馬魚的頭更小。因此,斑馬魚突變表型再現了人類小頭畸形表型。除了整體頭部尺寸減小,我們還發現突變斑馬魚頭部前后軸縮短。根據MAP11 SH- SY5Y敲除細胞的增殖和凋亡數據,我們發現野生型和MAP11 -ko斑馬魚的細胞凋亡水平(全身)沒有差異。有趣的是,我們證明與野生型相比,map11- ko斑馬魚的腦細胞增殖減少,這表明map11對斑馬魚神經發育早期的神經元增殖很重要。這與原發性小頭癥的一個關鍵分子特征是一致的,神經干細胞的低增殖能力導致一個枯竭的祖細胞池,不能產生足夠數量的神經元來填充正在生長的新皮質。

                總的來說,通過體外和體內的研究,我們證實了C7orf43(現在稱為MAP11)與有絲分裂紡錘體有關,并且在有絲分裂過程中與a-微管蛋白共同定位,并在生理上與a-微管蛋白結合,從而影響細胞增殖。我們證明了MAP11在中體細胞脫落間隙形成中先于A-微管蛋白的表達,并且在每個子細胞胞質分裂脫落后的微管延伸邊緣緣與PLK1共定位。我們的研究結果表明MAP11可能在有絲分裂時紡錘體動力學和細胞分裂中調控細胞脫落過程中發揮作用。最后,我們發現,與參與有絲分裂紡錘體組織、卵裂溝和中體調控的其他基因類似,MAP11功能突變的缺失在神經發育早期通過減少細胞增殖導致人類和斑馬魚的小頭畸形。

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